CRISPR-Cas9 hoạt động như thế nào? Ứng dụng lâm sàng hiện nay

Trong bài viết này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về CRISPR-Cas9, nhấn mạnh vào cách nó có thể tác động. Mặc dù nó có thể có tác động đáng kể đến nhi khoa thông qua các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm, nhưng ở đây chúng ta sẽ tập trung vào các ứng dụng lâm sàng tiềm năng của nó. Bài viết cũng sẽ mô tả một số khó khăn và tranh cãi về mặt đạo đức liên quan đến công nghệ mới này.

CRISPR-Cas9 là gì và hoạt động như thế nào?

CRISPR-Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gen bao gồm hai thành phần thiết yếu: RNA hướng dẫn để phù hợp với gen mục tiêu mong muốn và Cas9 (protein liên quan đến CRISPR 9) - một endnuclease gây ra sự phá vỡ chuỗi DNA kép, cho phép sửa đổi gen bộ gen.

Khái niệm CRISPR-Cas9

Hệ thống CRISPR/Cas9, các đoạn lặp lại palindromic xen kẽ đều đặn (CRISPR) đề cập đến các trình tự trong bộ gen của vi khuẩn. Chúng có khả năng bảo vệ chống lại virus xâm nhập khi được kết hợp với một loạt protein liên quan đến CRISPR (Cas). Cas9, một trong những protein liên quan, là một enzyme nội bào có tác dụng cắt cả hai chuỗi DNA. Cas9 được hướng tới mục tiêu của nó bằng một đoạn RNA. Điều này có thể được tổng hợp dưới dạng một chuỗi đơn gọi là RNA dẫn hướng đơn tổng hợp (sgRNA), phần RNA liên kết với DNA bộ gen là 18 - 20 nucleotide. Để cắt một trình tự DNA cụ thể có từ 2 đến 5 nucleotide (trình tự chính xác phụ thuộc vào vi khuẩn tạo ra Cas9) phải nằm ở đầu 3' của RNA dẫn hướng. Việc sửa chữa sau khi cắt DNA có thể xảy ra thông qua hai con đường:

• Nối đầu không tương đồng, thường dẫn đến việc chèn/xóa DNA ngẫu nhiên hoặc sửa chữa theo hướng tương đồng trong đó một đoạn DNA tương đồng được sử dụng làm mẫu sửa chữa.
• Chỉnh sửa bộ gen chính xác: Phần DNA tương đồng với sự thay đổi trình tự cần thiết có thể được phân phối cùng với Cas9 nuclease và sgRNA, về mặt lý thuyết cho phép những thay đổi chính xác như một cặp bazơ đơn lẻ.

Cách thức hoạt động

Hệ thống CRISPR-Cas9 bao gồm hai phân tử quan trọng tạo ra sự thay đổi (đột biến) trong DNA. Đó là:

• Một loại enzyme có tên Cas9, hoạt động như một cặp "kéo phân tử" có thể cắt hai chuỗi DNA tại một vị trí cụ thể trong bộ gen để sau đó các bit DNA có thể được thêm vào hoặc loại bỏ.
• Một đoạn RNA gọi là RNA dẫn hướng (sgRNA). Nó bao gồm một đoạn nhỏ của chuỗi RNA được thiết kế sẵn (dài khoảng 20 base) nằm trong một cấu trúc RNA dài hơn. Phần cấu trúc liên kết với DNA và trình tự được thiết kế sẵn sẽ “hướng dẫn” Cas9 đến phần bên phải của bộ gen. Điều này đảm bảo rằng enzyme Cas9 cắt đúng điểm trong bộ gen.
• RNA dẫn đường được thiết kế để tìm và liên kết với một trình tự cụ thể trong DNA. RNA dẫn hướng có các base RNA bổ sung cho các base của trình tự DNA đích trong bộ gen. Điều này có nghĩa là, ít nhất về mặt lý thuyết, RNA dẫn đường sẽ chỉ liên kết với trình tự mục tiêu và không liên kết với các vùng khác của bộ gen.
• Cas9 đi theo RNA dẫn đường đến cùng một vị trí trong chuỗi DNA và thực hiện cắt ngang cả hai chuỗi DNA.
• Ở giai đoạn này, tế bào nhận ra rằng DNA bị hư hỏng và cố gắng sửa chữa nó.
• Các nhà khoa học có thể sử dụng máy sửa chữa DNA để tạo ra những thay đổi đối với một hoặc nhiều gen trong bộ gen của tế bào quan tâm.

Ứng dụng CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 có rất nhiều tiềm năng trở thành công cụ điều trị một loạt bệnh lý có yếu tố di truyền, bao gồm bệnh ung thư, viêm gan B hoặc thậm chí là cholesterol máu cao.

Nhiều ứng dụng được đề xuất liên quan đến việc chỉnh sửa bộ gen của tế bào soma (không sinh sản) nhưng đã có rất nhiều sự quan tâm và tranh luận về khả năng chỉnh sửa tế bào mầm (sinh sản). Bởi vì bất kỳ thay đổi nào được thực hiện trong tế bào mầm sẽ được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác nên nó có ý nghĩa quan trọng về mặt đạo đức. Việc thực hiện chỉnh sửa gen trong tế bào mầm hiện là bất hợp pháp ở Anh và hầu hết các quốc gia khác.

Ngược lại, việc sử dụng CRISPR-Cas9 và các công nghệ chỉnh sửa gen khác trong tế bào soma là điều không cần bàn cãi. Thực tế, chúng đã được sử dụng để điều trị bệnh ở người trong một số ít trường hợp đặc biệt hoặc đe dọa tính mạng.

Có những kỹ thuật nào khác để thay đổi gen ngoài CRISPR-Cas9?

Trong nhiều năm, các nhà khoa học đã tìm hiểu về di truyền và chức năng gen bằng cách nghiên cứu tác động của những thay đổi trong DNA. Nếu bạn có thể tạo ra một sự thay đổi trong một gen, trong một dòng tế bào hoặc toàn bộ sinh vật, thì bạn có thể nghiên cứu tác động của sự thay đổi đó để hiểu chức năng của gen đó là gì. Trong một thời gian dài, các nhà di truyền học đã sử dụng hóa chất hoặc phóng xạ để gây đột biến. Tuy nhiên, họ không có cách nào kiểm soát được vị trí đột biến sẽ xảy ra trong cả bộ gen.

Trong nhiều năm, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp "nhắm mục tiêu gen" để tạo ra những thay đổi ở những vị trí cụ thể trong bộ gen, bằng cách loại bỏ hoặc thêm vào toàn bộ gen hoặc các bazơ đơn lẻ. Nhắm mục tiêu gen truyền thống rất có giá trị để nghiên cứu gen và di truyền, tuy nhiên phải mất nhiều thời gian để tạo ra đột biến và khá tốn kém. Một số công nghệ "chỉnh sửa gen" gần đây đã được phát triển để cải thiện các phương pháp nhắm mục tiêu gen, bao gồm hệ thống CRISPR-Cas, các hạt nhân tác động giống như chất kích hoạt phiên mã transcription activator-like effector nucleases (TALEN) và zinc-finger nucleases (ZFNs).

Hệ thống CRISPR-Cas9 hiện nổi bật là hệ thống nhanh nhất, rẻ nhất và đáng tin cậy nhất để “chỉnh sửa” gen.

CRISPR-Cas-9 trong tự nhiên được sử dụng để bảo vệ sinh vật khỏi sự xâm nhập của virus bằng cách nhận biết và phân hủy các yếu tố di truyền ngoại sinh. Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 được áp dụng từ khả năng miễn dịch thu được ở sinh vật nhân sơ và bao gồm hai yếu tố: RNA hướng dẫn được sử dụng để xác định (liên kết) DNA mục tiêu cần chỉnh sửa và Cas9, một loại protein về cơ bản cắt DNA tại vị trí được xác định bằng RNA hướng dẫn. Mặc dù đã có những nỗ lực to lớn nhưng vẫn còn một số thách thức trong ứng dụng thực tế và cần có nhiều cải tiến khác nhau để vượt qua những trở ngại nhằm đảm bảo lợi ích tối đa trong khi giảm tối thiểu rủi ro của CRISPR-Cas9.